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浅谈反相柱走高水相 ②

作者: YB   2020-07-21 16:37

  在上次的话题中,我们讨论了普通C18柱是否能够走全水或者高水相的话题。    

 接着上次的话题,今天小编就和大家讨论一下如何让小水滴舒舒服服心甘情愿地呆在疏水的反相柱表面。正如下面的示意图所示,当流动相是有机相时,由于有机相和反相柱表面亲和性更强,这个时候流动相能够充满孔道。而当流动相是水时,反相柱表面是疏水的,另外加上纳米孔的毛细管作用,使得流动相难以进入孔道。反相柱的保留性能大大地减弱,并且实验的重现性也降低。

       通过什么方式能够让水进入并且呆在孔道里来实现我们所需的分离效果和实验重复性呢?下面我们通过几个参数来讨论。


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讲到这里,小编不得不提一下毛细现象。毛细现象(又称毛细管作用)是指液体在细管状物体内侧,由液体与管道表面之间的附着力和因内聚力而产生的表面张力组合而成,植物根部吸收的水分能够经由茎内维管束上升,即是毛细现象最常见的例子。


针对反相柱表面和流动相之间的相互作用来说,如表一所示流动相的表面张力是由化合物的特性决定的,例如水的表面张力远远大于乙腈,而乙腈的表面张力又略高于甲醇。反相柱孔道表面和流动相之间的附着力的大小决定了流动相是否能够舒适地呆在孔道里。在高效液相正常运行的条件下,泵的压力可以突破孔道表面和流动性之间附着力的限制而使高水含量的流动相停留在孔道内,一旦泵停止运转,在无外力的作用下,由于水的表面张力系数过高,反相柱疏水的孔道表面和流动相的附着力不足以使水停留在孔道内,这个时候就会出现上一篇博文中的现象,流动相会被排斥出孔道。流动相一旦被排除孔道,分离物质的保留时间,实验的重复性都会受到严重的影响。

 表一:以下数据是液体在20℃时的测量数据:

液体

表面张力(mN/m)

n-己烷

18.4

乙醇

22.55

甲醇

22.60

28.9

乙腈

29.29

72.75

476




那么,有什么办法能够克服这些现象吗?

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图3:C18色谱柱在不同的温度下100%的全水流动相条件下泵运行时和停止后的保留行为。色谱柱:150 mm x 4.6 mm,5μm,C18,孔径10 nm; 流动相,100%水;流速1.0 mL / min。


1. 温度会有影响吗?

         从实验结果可以看出,对于5µm,10nm孔径的C18反相柱来说,温度越高,泵停止后再次进样保留时间的损失越大。而在30摄氏度和40摄氏度时即使在泵未停的情况下,保留时间都已经开始降低。解释这个现象恐怕要由十八烷的熔点说起,十八烷的熔点在29–30 °C,但是在二氧化硅微球表面键合的C18并不是和十八烷具有相同的相转变行为,因为C18链的一端是嫁接在硅胶表面的。Doyle 和他的合作伙伴用拉曼光谱研究了键合后的C18链在2–45 °C之间的光谱变化特征,随着温度得变化,C18链的光谱更加类似于液体十八烷的光谱特性,但是变化是逐渐而且连续的。这和图三得到的实验现象完全一致,保留行为的变化是渐进连续的,没有任何突变的迹象。同时这个结论也提示我们,如果需要在高水相条件下使用反相柱,为了提高实验的重复性,尽可能地选择在较低温度下运行。



2. 填料是否封端的影响


         在此处,小编引用一篇已经发表的数据。通过评估氢键结合能力,测量了键合相上残留的硅羟基基团的数量。氢键结合力越高,残留的硅羟基的数量越多。如表二所示,更广泛的封端减少了残留的硅羟基基团的数量,从而导致保留时间的重现性差。残留的硅羟基基团在固定相上作为极性基团起作用。具有高残留硅羟基含量的固定相的极性很高,因此,这些相与保留的极性相(如烷基酰胺和烷基氨基甲酸酯相)一样,具有很高的保留重现性。虽然没有封尾的反相柱具有很高的保留重现性,但是在中性pH和高水相条件下不稳定,因此这种类型的C18柱不能够在实际的分离案例中应用。

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表二:封尾对高水相条件下色谱柱保留性能重复性的影响。


3. 离子对试剂对高水相条件盐和离子对试剂的影响


         图四说明了盐和离子对试剂的作用。如这些图所示,相对保留率很大程度上受盐和离子对试剂浓度的影响。仅5 mM的离子对试剂显示出非常高的保留重现性。我们认为,盐和离子对试剂降低了流动相的表面张力,同时使固定相更具亲水性。由于表面张力低,亲水性高的固定相很容易将流动相保留在孔中。从填料的孔中排出水性流动相后,我们用浓度大于50%的有机溶剂洗脱了流动相,使流动相返回到孔中。在每次评估结束时,我们用70:30(v / v)乙腈-水冲洗色谱柱,并且色谱柱始终返回其初始状态。我们使用同一根色谱柱重复了几次实验,每次都获得相同的结果。

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图四:盐 (左)和离子对(右)试剂对全水相条件保留性能的影响。色谱柱: 150 mm X 4.6 mm,C18, 10-nm 孔径。pH都是7。


4. 柱后添加阻力对保留重现性的影响


         如图五所示,由于填料出口附近的压力非常低,因此从填料的孔隙中将其排出。如果在柱后和检测器之间接一根内径0.1 毫米,50厘米 长的管子,由于管径变细而阻力加大,在柱后会产生一定的压力。如果图五当背压为1.7 MPa,导致2-丙醇的保留时间从6.5分钟增加到7.2分钟。该背压也被认为是降低保留的再现性的因素。因此,柱后的背压使得保留的重现性高。在实际操作中,分析人员如果需要走高水相条件时,为了提高实验的高重复性,可以采用这个方法。

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图五:填料的状态。色谱柱条件和图三一致。

综上所述

反相HPLC色谱柱在100%水性条件下显示保留率降低,因为在这些条件下,流动相从填料的孔中排出,这导致固定相和流动相之间的接触减少。一些关键参数(温度,压力,封端以及盐和离子对试剂的浓度)会影响保留率的降低。并且操作温度低于10°C或向流动相中添加5 mM离子对试剂时,即使是普通的C18 HPLC色谱柱也能在100%的水相条件下显示出较高的保留重现性。


*文中部分数据出自LCGC NORTH AMERICA VOLUME 20 NUMBER 10 OCTOBER 2002。